Caracterización molecular de Mycoplasma gallisepticum y

Mycoplasma synoviae en ponedoras comerciales y

reproductoras pesadas de la zona centro de Colombia

Cesar Enrique Ventura Politte, MVMaestría Salud Animal

Línea de Microbiología y Epidemiologia Aviar

CONTENIDOGeneralidades de la micoplasmosis

Conclusiones y Recomendaciones

Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae

Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo

Generalidades de la micoplasmosis

Conclusiones y Recomendaciones

Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae

Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo

HISTORIA• 1898 en bovinos pleuroneumonia• En aves en los años 30- Sinusitis de

los pavos en 1938• Años 50, en pollos y pavos-ERC

Nocard y Roux, 1898; Nelson 1935; Dickinson y Hinshaw, 1938; Delaplane y Stuart, 1943;Markham y Wong, 1952; Van Roekel y Olesiuk, 1953

ETIOLOGÍA• Clase Mollicutes (mollis = suave y cutes = pared), • Orden Mycoplasmatales• Familia Mycoplasmataceae • Género Mycoplasma • 23 especies pueden afectar aves• Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma

sinoviae, Mycoplasma meleagris y Mycoplasma iowa

Kleven, 2000Browning & Markhan, 2004

600-1350 kpb, con 23-40 % de G-C, 740 genes. Funciones claras 469 genes.

Papasizi et al., 2003

GENOMA DE MG

EPIDEMIOLOGÍA

OIE, 2004;Kleven, 2006

Problemática de pollos, ponedoras, reproductoras y pavos

Aves silvestres y de traspatio

Distribución mundial

EPIDEMIOLOGÍATransmisión Horizontal y VerticalCondiciones de granja: alimento,

roedores, aguaReservorios y transmisores: Personas,

vehículos, Polvo, Insectos y BiofilmsBioseguridad

Kleven, 1996; Christensen, et al., 1994; Butcher, 2008

PATOGENICIDADCitoadhesinas – Hemaglutininas:

mgc2, vlhA , GapA , PvpA Perfil antigénico variableSon organismos intracelulares "Latencia "

Buyuktanir, et al., 2008; Razin, et al., 1998

DIAGNÓSTICO

Bencina et al., 1987;Bradbury & McClenaghan, 1982; Mardassi et al., 2008

IgM7-10 DPI

IgG15-21 DPI

ConfirmatoriaSerotipificación

Detección del material genético - ADN

Bencina et al., 1987;Bradbury & McClenaghan, 1982; Mardassi et al., 2008

Generalidades de la micoplasmosis

Conclusiones y Recomendaciones

Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae

Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo

DISTRIBUCIÓN GEOGRAFICA AVICULTURA NACIONAL

MINISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURALDEPARTAMENTO ADMINISTRATIVO NACIONAL DE ESTADÍSTICA-DANEFEDERACIÓN NACIONAL DE AVICULTORES DE COLOMBIA-FENAVIFONDO NACIONAL AVÍCOLA-FONAV

63 Granjas de Ponedoras Comerciales – GPC9,5 % del Censo145 Lotes

30 Granjas de Reproductoras Pesadas- GRP33 % del Censo48 Lotes

ENCUESTA Ubicación geográfica

Tamaño y número de lotes en la granja

Uso de vacunas de MG y MS

Edad – Raza – Granjas Cercanas

Tipo de Explotación y Tipo Instalación

Programa de Bioseguridad

MATERIALES Y MÉTODOS• Enero de 2010 y marzo de 2012. • Hisopos traqueales

MATERIALES Y MÉTODOS• 45 animales por cada uno de los lotes

presentes en las granjas• Un hisopo humedecido en PBS por cada

tres aves.

MATERIALES Y MÉTODOS• Lavado del total de hisopos como un pool. • Conservación en un recipiente estéril a -20 0C • Extracción por un procedimiento no fenólico

Modificado de Hernández et al., 2009;OIE, 2008

Primers Secuencia Gen Producto

MG-FMG-R

5' CGC AAT TTG GTC CTA ATC CCC AAC A 3' 5' TAAACC CAC CTC CAG CTT TAT TTC C 3'

mgc2 237 pb300 pb

MS-F 1MS-R 1

5´ CCA TTG CTC CTG CTG TTA T 3´ 5´ GAT TCT GTT GTA GTT GCT TCA A 3´

vlhA 300 pb

MS-F 2MS-R 2

5´ AGT AAC CGA TCC GCT TAA TGC 3´ 5´ GAT GCG TAA AAT AAA AGG AT 3´

vlhA 450 pb

28S-F28S-R

5´ GGC GAA GCC AGA GGA AAC T 3 5´ GAC GAC CGA TTT GCA CGT C 3´

28S 61 pb

García et al., 2005; Wetzel et al., 2010; Hammond et al., 2009; Suzuki et al., 2009

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

• Estadística descriptiva para las diferentes variables

• Pruebas de correlación de variables chi cuadrado

• Pruebas de regresión logística• Software estadístico Statistix 8.0

Mycoplasma gallisepticum

Cepa F

Cepa 6/85

POS NEG

300 pb

300 pb

Mycoplasma synoviae

POS NEG

POS NEG

300 pbWVU1853

450PbWVU1853

300 pb

450 pb

300 pb

500 pb

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

Cepa F Cepa 6/85

Cepa WVU1853 Cepa

WVU1853

300 pb

300 pb

200 pb

Alto porcentaje de positividad a MG y MS

0

20

40

60

80

MSMG

51,81

30,05

48,18

69,94

NEG POS

Po

rcen

taje

n : 193

Positividad a MG y MS

GRPGPC

0

20

40

60

80

100

MG

MS

45,8

20,8

77,9

57,2

Po

rce

nta

jeMayor positividad a MS en los dos tipos de

explotación

p<0,05

Variables sin diferencias estadísticasGPC

Ponedoras comerciales

GRPReproductoras

PesadasAltitud 268-2780 m.s.n.m

p>0,051010-2572 m.s.n.m p>0,05

Tamaño de los lotes

1000 – 121380 avesp>0,05

770 – 36300 avesp>0,05

Departamento p>0,05 p>0,05

Tipo de Instalación

p>0,05 p>0,05

BioseguridadCumplimiento de 6 parámetros

61,8 % p>0,05

100 %

Variables con diferencias estadísticasGPC GRP

Raza 5 Razas p<0,05 en MG 20 – 73 %p<0,05 en MS 60 – 91 %

2 razas p<0,05 en MG 4 – 36 %p<0,05 en MS 39 – 52 %

Grupos Etáreos p<0,05 MG 13% al 74 %p<0,05 MS 13 % al 94%

p<0,05 MG 17% al 33 %p<0,05 MS 17% al 100%

Numero de lotes 1 – 10 p>0,05 en MS p<0,05 para MG 40% - 83%

1 - 3 lotes p>0,05

USO de Vacunas MG y MS

35,2 % MG p>0,050% MS

91,7 % MG p>0,050 %

Infecciones Mixtas MG y MS

POS MG y MS0

20

40

60GPC

GRP

8,3

55,2

Po

rce

nta

jeMayor positividad mixta en Ponedoras Comerciales

Generalidades de la micoplasmosis

Conclusiones y Recomendaciones

Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae

Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo

Cepas MG Sitios de corte HaeIII en el gen mgc2 de MG Longitud de losFragmentos

Cepa F

TCGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAATCCACAGGGTTTTGGTGGCCCAATGCCACCTAACCACATGGGGATGCGGCCAGGGTTTAACCAAATGCCGCCACAAATGGGTGGGATGCCACCTAACCACATGGGGATGCGGCCAGGGTTTAACCAAATGCCACCTAACCAAATGGGTGGAATGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATGCCTAATATGAATCAACCAAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGTCTCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGGTTTAAA

31 pb 53 pb 63 pb 157 pb

Cepa 6/85

TCGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAACCCGCAGGGCTTTGGTGGCCCAATGTCACTTAACCAAATGGGGATGCGACCAGGGTTTAACCAAATAGCCCCCACAAATGGGAGGAATAGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATAGCCTAATATGAACCAACCAAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGCGCCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGG

53 pb 184 pb

Cepa R

CGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAACCCACAGTGCTTTGGTGGCCCAATGCAACCTAACCAAATGGGAATGCGACCAGGGTTTAACCAAATGCCCCCACAAATGGGAGGAATGCCACCTAACCAAATGGGAATGCGACCAGGGTTTAACCAAATGCCCCCACAAATGGGAGGAATGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATGCCTAATATGAACCAACCTAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGTGCCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGGTTTA

52 pb248 pb

Acceso Genbank AY556230.1; AY556231.1 y AY556228.1

PCR-RFLP para diferenciar cepas de MG

www.insilico.ehu.es

MG 300

157 184

HaeIII 63

53

31

53

MG 237

248

52

CampoCepa F

6/85

Lectura de Patrones de restricción para M. gallisepticum

ROJO: Patrón 1

AMARILLO: Patrón 2

Identificación de patrones RFLP de MG con Tinción de plata

Control Cepa

F

Muestra con

Patrón1

Control Cepa6/85

Muestra con

Patrón1

Muestra con

Patrón2

100pb

40pb

200pb

60pb

300pb

160pb

Patrones RFLP de MG

POS MG0

20

40

60

80Patron 1

Patron 260,2

39,8

Po

rce

nta

jeMayor porcentaje de cepas de campo de

MG

n:93

Sin diferencias estadísticasPatrón 1 Patrón 2

Altura p>0,05 p>0,05

Número de lotes en las granjas

p>0,05 p>0,05

Tamaño de los lotes p>0,05 p>0,05

Departamento p>0,05 p>0,05

Bioseguridad cumplimiento de 6 parámetros

p>0,05 p>0,05

Con diferencias estadísticasPatrón 1 Patrón 2

Raza p<0,05 7 – 40 % GPC

p<0,05 2 – 53 % GPC

Tipo de Instalación

p<0,05 Jaulas 22% - Piso 57%

p<0,05 Jaulas 5-9 %- Piso 86 %

Tipo de Explotación

p<0,05 30% GPC- 90% GRP

p<0,05 70% GPC- 10 % GRP

Generalidades de la micoplasmosis

Conclusiones y Recomendaciones

Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae

Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo

Secuenciación de 80 muestras

seleccionadas

MS46 muestras

MG34 muestras

Patrón 222 muestras

Patrón 112 muestras

Única Banda36 muestras

Doble banda10 muestras

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTAcceso Genbank AY556230.1 , HQ591358.1, AY556228.1

Patrón 1 Patrón 2

96-100 % Entre ellas

96-100 % entre ellas

96-99% con la Cepa F

Cepa F control 98% y 100% Eis7C10

96-98 % cepa R de referencia

Similaridad de las secuencias de MG

Nucleotide Substitutions (x100)0

16.6

246810121416

AY556230.1 Strain F.s eqMG189.seqHQ591358.1 Eis7-C-10.seqMG20.seqMG61.seqMG86.seqMG126.seqMG27.seqCepaF.s eqMG13.seqMG7.s eqMG69.seqMG172.seqMG12.seqAY556231.1 Strain 685.seqVacuna 6-85.s eq

Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10®Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1

_________________

_________________

__________________________________

Patrón 1 en Muestras de campo

Nucleotide Substitutions (x100)0

23.4

5101520

MG54.seqMG139.seq

MG142.seqMG149.seqMG143.seqMG85.seqMG94.seq

AY556229.1 Strain S6.seqMG186.seqMG22.seqMG29.seqMG46.seqMG190.seq

MG194.seqMG156.seq

AY556228.1 strain R.s eqMG165.seq

MG70.seqMG89.seq

MG72.seqMG75.seq

MG201.seqAY556230.1 Strain F.s eq

AY556231.1 Strain 685.seq

Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10®Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1

_________________

Patrón 2 en Muestras de campo

__________________________________

Similaridad de las secuencias de MS

Se escogieron un grupo de cepas con mas alto porcentaje de similaridad en BLAST

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTGenbank HQ326484.1; DQ661614.1; FM164370.1; AB507391.1 ; FJ495803.1

83,2 % - 96,9 % Entre ellas

40-99 % En muestras de doble banda

Similaridad de las secuencias de MS

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTGenbank HQ326484.1; DQ661614.1; FM164370.1; AB507391.1 ; FJ495803.1

Cepa WVU1853 : 38,9 % - 43,8 %

Cepa EEA: 82 % - 97 %

Cepa 94011: 89 % - 96 %

Cepa NZMSID181: 82 % – 98 %

Cepa B45/04: 88 % - 95 %

Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10®Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1

Nucleotide Substitutions (x100)0

77.7

10203040506070

MS30.seqMS21.seqMS101.seq

MS12.seqMS142.seqMS149.seq

MS87.seqFM164370.1 Strain B45 04.seq

MS51.seqAB507391.1 Strain NZMSID181.seqDQ661614.1 Strain 94011.seq

MS134.seqFJ495803.1 Strain EAA.seq

MS62.seqMS43.seqHQ326484.1 WVU1853.seq_________________

_________________

__________________________________

_________________

Productos de MS de una sola banda

Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10®Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1

Nucleotide Substitutions (x100)0

58.1

1020304050

MS28.seqMS190-1.seqMS37.seqMS37-1.seqMS104.seqMS104-.seqMS60-.s eqMS76-1.seqAB507391.1 Strain NZMSID181.seqMS194.seqMS28-1.seqMS76.seqFM164370.1 Strain B45 04.seqFJ495803.1 Strain EAA.seqMS194-1.seqMS52-1.seqDQ661614.1 Strain 94011.seqMS52.seqMS60.seqHQ326484.1 WVU1853.s eq

Productos de MS de dos bandas

_________________

_________________

_________________

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Generalidades de la micoplasmosis

Conclusiones y Recomendaciones

Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae

Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo

CONCLUSIONES• Alta presencia de MG y MS de campo

en los dos tipos de explotación en estudio.

• Mayor presencia en granjas multiedad y mayor edad de los lotes

• Posibilidad de Transmisión Vertical

CONCLUSIONES• Infecciones mixtas que afectan el

manejo farmacológico y vacunal de lo agentes a nivel de granja

• Se debe determinar el uso y la importancia del uso de vacunas para el control de la enfermedad en las granjas

RECOMENDACIONES• Estudios que involucren todas las etapas de

producción en los diversos tipos de explotación

• Evaluación de programas vacunales • El mismo tipo de estudio en otras zonas

avícolas del país• Evaluar interacción de micoplasmas con

otros patógenos respiratorios