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Biotecnología e Ingeniería Genética

Universidad Nacional de Quilmes

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“BIOTECNOLOGÍA”

Definición: Biotecnología es la utilización de los seres vivos y/o sus derivados para la generación

de productos o servicios.

Para ello se requieren los conocimientos de todas las grandes áreas científicas: Microbiología, Biología General y Molecular, Ing. Química, Química Orgánica, Bioquímica, Fisicoquímica, Matemática, Física, Informática, etc.

¿Seres vivos?

Bacterias

Levaduras

Animales

Hongos

Vegetales

Organismos unicelulares

Organismos multicelulares

Biotecnología clásica

Biotecnología moderna

Utiliza a los seres vivos tales como se los encuentra en la naturaleza... Solo incluye mejoras de organismos por genética clásica.

A partir de las técnicas de Ingeniería

Genética podemos modificar a los

organismos y sus partes para sacarles

mayor provecho.

Mejoramiento vegetal por cruzamiento y selección“Genética Clásica”

Cdk Cdk sdnr hmsdsdnr hmsd ` k ` k l ` Áyl ` ÁyLycopersiconesculentum

Lycopersiconperuvianum

Snl ` sd bnl dqbh̀ kSnl ` sd bnl dqbh̀ k Dr odbhd r hkudr sqdDr odbhd r hkudr sqd

Biotecnología clásica

Productos de Fermentación en alimentos:- Etanol: cerveza, vino, sidra, ron, etc.- Ácido Láctico: yogurt, ricota, leche cultivada.- CO2: panificación.- Ácido acético: vinagre.

Otros productos más recientes en la historia:- Aminoácidos- Ácido cítrico- Gas metano

Servicios:- Depuración de residuos cloacales.- Biorremediación- Biolixibiación.- Biofiltros

Biorreactores“El caldo de cultivo”

IngredientesMicroorganismo

Temperatura Nutrientes

OxígenoAgua

Mezclar y esperar!

Biotecnología moderna

Procariotas vs eucariotas

Genoma de E. Coli 1,2 Mb

Genoma de un mamífero 3 Gb

Hibridación del DNA

Temperatura de melting

sondas

Oligonucleótido de simple cadena, marcado y secuenciado

Electroforesis: ADN y ARN

Geles de:

- Agarosa

- Poliacrilamida

Permite separar las moléculas de DNA y RNA por tamaño

Electroforesis: ADN y ARN

Transferencia Southern

Transferencia Northern

Southern blot y el análisis de

identidad

Hibridación in situ

Sonda radiactiva anti mRNA del gen ftz

Microarray

Método químico: “Maxam y Gilbert”

Secuenciación de DNA

Método enzimático: “Sanger”

2’-3’ dd NTPs

Ciclos:

-Desnaturalización92-95 ºC

- Hibridación35 – 60 ºC

- Polimerización72 ºC

Ingredientes:Ingredientes:- Buffer específico - DNA molde- Primers- dNTPs- TAQ - Mg++

Objetivo. Obtener múltiples copias de una determinada secuencia de DNA a partir de unas pocas

“PCR” Reacción en cadena de la polimerasa

PCR en medicina forense

VNTR: variable number of

tandem repeat

...GTGTGT...

Enzimas en la tecnología del DNA

“ER” Endonucleasas de Restricción

Ext. Romos

Ext. Cohesivo 3’ protruyente

Ext. Cohesivo 5’ protruyente

En general reconocen secuencias palindrómicas

“ER” Endonucleasas de Restricción

DNA ligasa

RFLP: Polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción.

Mapa de restricción

Vectores de Clonado

Componentes mínimos:- Origen de replicación.- Gen marcador de selección.- Sitios de restricción: “polylinker”http://image.llnl.gov/image/html/vectors.shtml#pcDNA3.1

Plásmidos: 3 y 10 kb; aceptan insertos de hasta 10 kb.

Agregar mas vectores

Fagos: 50 kb; aceptan 15 kb

- Cósmidos: híbrido plásmido-fago L; 35-40 kb- Fásmidos: híbrido plásmido- fago M13.- Cromosomas artificiales “BACs”, “PACs” y “YACs”100 a 500 kb

OTROS TIPOS DE VECTORES:

VECTORES DE EXPRESIÓN:

Vector de expresión en eucariotas Vector de expresión en procariotas

Transfección de DNA a una célula huésped

TransformaciónDNA desnudo

Inyección de DNAElectroporaciónCañón génicoCalor – Cl2CaLipofectamina

policationes - PEI

Transducciónfagos lambda

Conjugaciónplásmidos \ célula-célula

bacteria-bacteriaagrobacterium

Paso a paso...

Genotecas

Biblioteca Genómica

Biblioteca de cDNA

Transcriptasa Reversa “RT”

screening

Hibridación

Actividad EZ

Anticuerpos

OGMs o Transgénicos

Modificación del genoma de un organismo

- Recombinación homóloga.- Transposones.- Inserción al azar.

Knock-in y knock- out

RNA antisentido o RNAi Knock-in y knock- out

Biotecnología Vegetal

Tabaco transgénico: GFP

Biotecnología Animal en Argentina

BIOSIDUS y Pampita

PROYECTO TAMBO FARMACEUTICO

2002 Nacen Pampa, primera ternera clonada de Latinoamérica y Pampa Mansa, portadora del gen de hormona de crecimiento.

2004 Nacen Pampa Mansa II y III primeros clones de transgénicos.

2004 Nace Pampero, primer transgénicovacuno macho, perpetuador del Tambo Farmacéutico.

http://www.sidus.com.ar/web/biosidusweb.nsf/?Open

http://www.argenbio.org/h/biotecnologia/11.php

Biotecnología vegetal en Argentina

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Proceso de autorización y puesta en el mercado de materiales que hayan pasado por las manos de la ingeniería genética.

1. CONABIA(Comisión Nacional de Biotecnología Agropecuaria)Analiza los potenciales impactos de los organismos genéticamente modificados sobre el medio ambiente.

2. SENASA(Servicio Nacional de sanidad y calidad agroalimentaria)Evalúa la inocuidad alimentaria para consumo humano y animal.

3. Dirección Nacional de Mercados AgroalimentariosEvalúa el potencial impacto sobre los mercados de exportación.

Proceso de Bioseguridad Nacional

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Trabajo práctico 1 y 2

Extracción de DNA plasmídico a partir de bacterias.Miniprep - hidrólisis alcalina

Cuantificación y análisis de pureza del DNA

Chequeo del extracto por electroforesis en gel de agarosa

Extracción de DNA plasmídico a partir de bacteria.Miniprep - hidrólisis alcalina

Soluciones necesarias:Solución 1: Tris 10 mM, EDTA 25 mM, pH 7,5.Solución 2: glucosa 40 mM, EDTA 10 mM (pH 8,0), Tris HCl25 mM (pH 8,0).Solución 3: NaOH 0,2 N, SDS 1% (w/v). Preparar en el momento de usar.Solución 4: Kac 3M + Hac, pH 4,8. Mantener a 4 ºC.

Cuantificación y análisis de pureza del DNA

Chequeo del extracto por electroforesis en gel de agarosa

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