Biología del Desarrollo

María Eugenia Cabrejos, PhDAño 2006

• Aristóteles (350 a.C.):– Analiza embriones de pollos de distintos estadíos de

gestación• Marcelo Marphigi (1672)::

– Descubrimiento de microscopios e inicio de observaciones en pollo.

• Nace gran controversia:– Epigénesis vs Preformación• Wolff KF (1767):“fuerza esencial, como la garvedad, que guía la orgnización del desarrollo embrionario”

Orígenes de la Biología del Desarrollo como Ciencia

Pander Ch • describe las tres capas germinales• indicios acerca del proceso de inducción• sustenta la epigénesis

von Baer (1828)– describes notocorda– describes similitudes en el desarrollo

temprano de vertebrados

Principio de von Baer

• Las características generaizadas de un amplio grupo de animales (phylum, clase) se forman al comienzo, mientras que las especies se van diferenciando más tarde con la aparición de otras estructuras más complejas.

• Carácter del desarrollo: generalizado específico.

• Los embriones de distintas especies son similares al de otras especies, no así los adutos.

• Un embrión “no pasa” por las etapas adultas de animales menores: ontogenia no recapitula a la filogenia.

Modelos de la Biología del Desarrollo

D.melanogaster D.rerio X.laevis

C.elegansG.gallusM.musculus

Métodos Moleculares

•Knock-out•Integrational mutagenesis•Classic geneticsTransgenics

•(microinjection)•Electroporation, •lipofection, •transgenics

•Reporter genes

DNA (gen)

•RNAi & •siRNA•Morpholinos

•microinjection•Northern Blot•RNase protection assays•microarrays•RT-PCR•in situ Hibrydisation

RNA

•pharmacological inhibitors, •dominant-negative proteins, • protein depletion using antibodies

•(adding proteins to in vitro reactions)

•Western Blot•Proteomics•immuno-histochemisty•protein chimera

Protein

III. InhibitionII. OverexpressionI. Analysis

I. Determinación de mapas de Destino.

• Estudio global de la expresión génica: gen A es expresado de forma adeucada en un tejido y en una etapa adecuada para mediar el proceso B.

III. Experimentos de ganancia de función: el producto génico del gen A es suficiente para mediar el proceso B.

IV. Experimentos de pérdida de función: el producto génico del gen A es normalmente requerido para mediar el proceso B.

V. Análisis del experimento: evidenciar el fenotipo o expresión del marcador génico.

¿Cómo estudiar la relación: expresión génica en tiempo y espacio vs. respuesta morfogenética?

Base experimental de la Embriología

Mapa de Destino

de diferentes clases

de vertebrados

en etapade gástrula

temprana.

Mapa de Destino

de un embrión tunicato.

Observación de embriones “vivos”

Marcadores vitales

Marcación fluorescente o radioactiva(Transgénicos)

QuickTime™ and aSorenson Video 3 decompressorare needed to see this picture.

Marcadores genéticos como trazadores de linaje celular

(Transplante)

DesarrolloInductivo vs Autónomo

Generación de sondas antisentido

Clonamiento cDNA flanqueado por promotores de RNA polimerasas virales - ensayo de run off -uso de ribonucleótidos modificados para facilitar la detección

Detección de mRNA en tejidos: Hibridación in situ

Whole-mount

in situ hybridisation

in X.laevis

Ganancia de función

•Inyección mRNA

•Inyección dsDNA(con un promotor inducible)

•Electroporación de mRNA, dsDNA

Ganancia de función

•Implantación microesferas embebidas con proteínas

Ensayo de Western blot

Microscopía y reconstrucciones 3D

Base experimental de la Embriología

c)

e)

Biología del Desarrollo

Objetivos Generales

•Crear diversidad celuar y orden entre cada generación

•Asegurar continuidad de la vida entre una generación y otra

Desarrollo Temprano en D.rerioMorfogénesis:

Proceso por el cual las células embrionarias hacen uso de una variedad de comportamientos para generar un tejido nuevo en respuesta a señales inductivas.La inducción y la morfogénesis son eventos mutuamente dependientes.

Aspectos relevantes:

1. Procesos morfogenéticos en el desarrollo

2. Comportamientos celulares en la morfogénesis

3. Desarrollo embrionario temprano en modelos invertebrados y vertebrados

* Clivaje* Gastrulación

4. Aproximación al proceso de neurulación

Proceso Ejemplos

Distintas tasas de proliferación Crecimiento selectivo de primordios(extremidades vertebrados).

Posicionamiento alternativo y/oorientación del uso mitótico

Distintos patrones de clivaje. Divisiones celularesestereotipadas (nemátodos).

Cambio de tamaño celular Expansión celular durante epibolia.

Cambio de forma celular Cambio de columnar a cuña durante cierre tuboneural (aves y mamíferos).

Fusión celular Formación trofoblasto y miotúbulos (mamíferos).

Muerte celular Separación de dígitos (extremidades vertebrados)

Ganancia adhesión célula-célula Condensación del mesénquima cartilaginoso(extremidades verteb.).

Pérdida adhesión célula-célula Delaminación de células del epiblasto(gastrulación mamíferos).

Interacción célula-matriz Migración: células cresta neural y germinales, axón.

Pérdida adhesión célula-matriz Delaminación de células desde lámina basal deepidermis.

Procesos morfogenéticos en el desarrollo

Comportamientos celulares en el desarrollo

Ingresión - Egresión Movimiento de células hacia dentro o fuerade la superficie

Delaminación Salida de células de la capa epitelial(aumento número de capas)

Intercalación Movimiento de células dentro de capaepitelial (disminución número de capas)

Condensación Células dispersas se agregan para formarepitelio (transición mesenquimal – epitelial)

Dispersión Capa epitelial se desarma en célulasmesenquimáticas.

Movimiento de células individuales

Comportamientos celulares en el desarrollo

Movimiento de capas celulares en grupos

Invaginación – Evaginación Plegamiento de capas celulares para formar pliegueo protrución

Involución Curvamiento hacia adentro de capa celular enexpansión. Extensión sobre superficie interna decapa (generación de segunda capa)

Epibolia Extensión de capa celular dirigida por intercalacióno proliferación celular.

Extensión convergente Combinación de procesos que resulta enconvergencia hacia el organizador y extensión eneje A-P. Convergencia involucra epibolia (?) einvolución y e xtensión involucra intercalaciónextensiva.

Visualización movimientos capas celulares y células individuales

Desarrollo embrionario temprano

- Clivaje:Divisiones celulares del cigoto en blastómeras menores. En general divisiones rápidas y sincrónicas controladas por productos de genes maternos (excepción mamíferos).Tipos de clivaje dependen de:

- orden y orientación de las diferentes divisiones celulares- cantidad de vitelo en el ovocito

Transición de blástula media:

- activación del genoma cigótico- enlentecimiento de divisiones celulares- pérdida de sincronía

- Eventos celulares particulares en algunos modelos.

- Gastrulación: Serie compleja de movimientos celulares coordinados, que culmina con la formación de las tres hojas embrionarias y el establecimiento de los ejes corporales.

Tipos

De

Clivaje

Gastrulación zebrafish

Blastula: blastodermo con tres poblaciones celulares - YSL: ciclo cel. 9-10 celulas vegetales se fusionanan con vitelo, EVL: monocapa epitelial de cel. superficiales, cel. profundas: originarán embrión.

Clivaje meroblástico discoidal

Expresión: no tail - notocorda, snail - mesodermo paraxial

Gastrulación Pollo

Línea primitiva: Ingresión de precursores endodérmicos al blastocele y migración de células desde regiones laterales del epiblasto posterior a línea media. Extensión hasta 60-75% largo del embrión.

Nodo de Hensen: Ingresión células individuales desde extremo anterior de línea primitiva y migración hacia anterior, desplazando hipoblasto (forma media luna germinal). Ingresan células precursoras de endo (tubo digestivo) y meso (cabeza y notocorda anterior).

Surco primitivo: Ingresión de células desde regiones laterales a línea. En blatocele separación en dos poblaciones una capa profunda que desplaza al hipoblasto lateral (endodermo) y una capa intermedia de células más “sueltas” (mesodermo).

Regresión del surco primitivo: Nodo de Hensen comienza a regresar a regiones más posteriores, dejando formada la notocorda a su paso.

Existe también epibolia del ectodermo por proliferación celular.

- Embrión con desarrollo en gradiente.

Acción de moléculas de señalización - factores Paracrinos

• Factores inductores que controlan la formación de órganos.• Mitógeno que regula la proliferación celular.• Morfógeno que actúa en forma dosis-dependiente para

regular el destino celular en un campo determinado.

Establecimiento de los ejes: A/P; D/V; D/I

Paradigma de la expresión Génica Diferencial

El patrón resultante puede involucrar la interpretación de una información posicional.

Interpretación de GradientesDiseño de patrones celulares

Competencia y Diferenciación Celular

Especificación Celular

La madre aporta productos génicos localizados que establecen polaridad a lo largo de los ejes A/P y D/V del ovocito.

Esta polaridad se traduce en destinos celulares específicos

Modelo General

de Establecimiento

eje A/P

Expresión Genes

Homeóticos en

Drosophila

Interacción Homeodominio- DNA

Hox-C: genes parálogos

Determinación eje D/V

en Drosophila

Determinación neural en vertebrados

¿Qué parte del embrión se transformará en SN?¿Cómo se diferencia dorsal de ventral en el tubo neural?¿Cómo se diferencia anterior vs posterior en el tubo neural?

Especificación de ejes

Spemann, 1924

En X.laevis

En D.rerio

Diencéfalo

PLM

Tailbud spaw

cyc

lefty2

cyclefty1pitx2

pitx2

?

OepOep

lefty

1

I

A

P

D

Esquema de vía de señalización Nodal“Flujo”

B

A

Desarrollo de la médula espinal

Jessell T.M, 2000

Wnt’s

II

Fore Mid Hindbrain

III eye

Cephalic Caudal

I

A P

Especificación Antero-posterior en cerebro de vertebrados

Fore Mid Hindbrain Wt

Mutantes de la vía Wnt afectan el patrón AP

eye

Fore Mid Hindbrain mbl/axin1

Especificación neuronal en la médula espinal: una acción combinada de señales inductivas

y códigos transcripcionales

Jessell T.M, 2000

Interpretación del gradiente de Shh: El papel combinatorio de las proteínas con homeodominio de

clase I y clase II define cinco dominios de células progenitoras

Proteínas de clase I (Pax7,Dbx1, Irx3,Pax6 y Dbx2),

Proteínas de clase II (Nkx6.1 y Nkx2.2)…

Proceso en Humanos

Leonardo Da Vinci, (1452-1519)