José Emilio Rebollo FeriaCáceres, 14 de noviembre, 2013

El Biocontrol es la eliminación o interferencia de especies biológicas parásitas, patogénicas o contaminantes mediante el uso de especies antagonistas

Es clásico en el uso de insectos depredadores, parásitos o hervívorospara el control de plagas en agricultura

Larva de la mariquita Harmonia axyridis depredando a los áfidos fitófagos Eriosoma lanigerum

Aunque surge en el campo de la Entomología, puede aplicarse a cualquier sistema depredador-presa, en el que se pretenda la eliminación controlada de ésta última

También aves o mamíferos pueden ser útiles en biocontrol

En el extremo opuesto de la escala biológica, los bacteriófagos o fagos son organismos acelulares que infectan y lisan bacterias de forma específica

La lisis bacteriana provocada por bacteriófagos es fácil de visualizar:

• Se forman halos de lisis en un tapiz

• Se interrumpe el crecimiento en estrías

• Se clarifica un cultivo infectado

Biocontrol de bacterias en procesos de fermentación láctea: protección de la actividad de cultivos

iniciadores y reducción de interferencias microbian as

QUESERÍAS ALMONTE SL (Deleitosa, Cáceres)QUESOS DEL CASAR SL (El Casar, Cáceres)HNOS. PAJUELO, S.A.T. (Almoharín, Cáceres)TENTUQUESO SL (Monesterio, Badajoz)LACTOCYEX SL (Malpartida, Cáceres)

Consejo Regulador D.O.P. Torta del CasarConsejo Regulador D.O.P. Quesos de Ibores

QUESERÍAS ALMONTE SL (Deleitosa, Cáceres)QUESOS DEL CASAR SL (El Casar, Cáceres)HNOS. PAJUELO, S.A.T. (Almoharín, Cáceres)TENTUQUESO SL (Monesterio, Badajoz)LACTOCYEX SL (Malpartida, Cáceres)

Consejo Regulador D.O.P. Torta del CasarConsejo Regulador D.O.P. Quesos de Ibores

ÁREA DE GENÉTICA (Facultad de Ciencias, UEx) y DEPARTAMENTO DE LÁCTEOS (INTAEX, CICYTEX)

Finca La Orden Valdesequera (CICYTEX)Área de Microbología (Facultad de Ciencas, UEx)

La contaminación por Escherichia coli esuna de las principales causas de hinchazónen quesos, provocando importantespérdidas

Con nuestro proyecto nos proponemosobtener bacteriófagos útiles para laeliminación de las cepas de Escherichia

coli que interfieren la producción deQuesos de Ibores y Tortas del Casar

1. Aislamiento y caracterización de bacterias

2. Aislamiento de bacteriófagos

3. Selección de fagos líticos o bacteriostáticos

4. Diseño de un cóctel de fagos

5. Caracterización de los bacteriófagos útiles

6. Pruebas del cóctel en laboratorio en medios líquidos

7. Pruebas del cóctel en planta piloto

8. Pruebas del cóctel en queserías

9. Pruebas del cóctel en ganaderías estabuladas

Diseño experimental del proyecto

1. Aislamiento y caracterización de bacterias• Determinación de niveles de mesófilos totales, enterobacterias,

coliformes y E. coli.

• Evolución microbiana a lo largo de la maduración

• Aislamiento de coliformes

• Aislamiento de cepas autóctonas de E. coli a partir de queserías y ganadería

BiologAnálisis microbiológico

1. Aislamiento y caracterización de bacterias

SDS-PAGE fingerprinting

1. Aislamiento y caracterización de bacterias

OTU1-RT396OTU2-RT1OTU3-RT12OTU4-RT381OTU5-RT3OTU6-RT472

2. Aislamiento de bacteriófagos

• SE HAN REALIZADO 39 AISLAMIENTOS DE BACTERIÓFAGOS A PARTIR DE 12 CEPAS DE Escherichia coli AUTÓCTONAS

1. Se indujo el ciclo líticos de los profagos residentes por tratamiento con mitomicina C

2. Se prepararon suspensiones purificadas de fagos sobre MG1665

• SE HAN OBTENIDO 8 DERIVADOS CLAROS A PARTIR DE TRES DE LOS NUEVOSBACTERIÓFAGOS ASÍ COMO DERIVADOS CLAROS Y VIRULENTOS DEL FAGOLAMBDA

1. Se trataron con UV (dosis bajas) las suspensiones de fagossilvestres

2. Se localizaron los halos de lisis claros sobre MG1665 para losmutantes claros o sobre MG1665 (λ+) para aislar derivados virulentos

3. Se prepararon suspensiones purificadas de fagos sobre MG1665

Inducción de profagos y derivados claros y virulento s

2. Aislamiento de bacteriófagos

• SE HAN REALIZADO 44 AISLAMIENTOS DE BACTERIÓFAGOS A PARTIR DE HECES DE OVEJA:

1. Detección por el método de la gota (picar agar con virus a partir de zonas de lisis)

2. Obtención de una suspensión de fagos sobre cepas autóctonas

3. Titulación sobre la misma cepa y sobre MG1665

4. Puriricación de halos aislados y obtención de suspensiones de bacteriófagos

• ENCONTRAMOS FAGOS TURBIOS Y CLAROS CON DIVERSOS TAMAÑOS Y MORFOLOGÍA

Aislamiento de fagos a partir de heces de oveja

3. Selección de fagos líticos o bacteriostáticosFAGOS DE

LABORATORIO

Lambda (λ)λvir*

λcI60

λind-

λcI ind-(ts)857

λimm434

λimm21

T2T4T6

P1vir

φ80φ80 c-

• Cepa obtenida

en este trabajo

Cruce de estrías

3. Selección de fagos líticos o bacteriostáticos

Cruce de estrías

Fagos: 1: Hof13; 2: Homg3; 3: Homg514; 4: Homg565.1; 5: Homg565.2

1

2

3

4

5

3. Selección de fagos líticos o bacteriostáticos

Cruce de estrías

4. Diseño de un cóctel de fagosHof13 Homg3 Homg514 Homg565.1 Homg565.2

CÓCTEL 3

CÓCTEL 5

5. Caracterización de bacteriófagos útiles

Halos de lisis: forma y tamaño

Hort394 Homg97 Homg565.2

Homg511 Homg3

Hof13

Hof13

5. Caracterización de bacteriófagos útiles

Halos de lisis: forma y tamaño

Hort394 Homg97 Homg565.2

Homg511 Homg3 Hof13

Bacteriófagos del Orden Caudovirales. Constituyen más del 95% delos fagos existentes. Tienen cola y ADN bicatenario. A: Mioviridales,con cola contráctil y placa basal. B: Siphoviridales, con cola larga yflexible. C: Podoviridales, con cola casi inexistente y placa con fibras.

5. Caracterización de bacteriófagos útiles

5. Caracterización de bacteriófagos útiles

Microscopía electrónica de transmisión

fRT59c Hof13 Hort380 Homg519.2

Homg478.1Homg518Homg518 Homg478.1

5. Caracterización de bacteriófagos útiles

En progreso:

• Caracterización molecular de los genomas viraleso Electroforesis en campo pulsanteo Patrones de restricción

• Secuenciación completa de los bacteriófagos útiles en cócteles

• Diseño de sistemas de detección específica de bacteriófagos en medios sólidos y líquidos

6. Pruebas del cóctel en medios líquidos

• ANÁLISIS DE LA LISIS EN MEDIOS DE LABORATORIO

• Composición de los primeros cócteles de fagos

Cóctel 1

FAGOS STANDAR:- Lambda vir- T4- P1

Cóctel 2

FAGOS AISLADOS DE CEPAS DE E.coli PROCEDENTES DE QUESERÍAS:- 6RT97- fRT3c-fRT12c

6. Pruebas de cócteles en medio LB

0,001

0,01

0,1

1

10

0 100 200 300

D.O 472

D.O 472+COCTEL1y21ml

0,01

0,1

1

10

0 100 200 300

0,01

0,1

1

10

0 100 200 300

El umbral de m.o.i. que determina la lisis varía de unas cepas a otras

RT472

m.o.i. < 1 m.o.i. ≈ 10 m.o.i. ≥ 100

Fagos cóctel 2 (m.o.i. < 1)

RT3 RT12

0,01

0,1

1

10

0 50 100 150 2000,01

0,1

1

10

0 100 200

0,01

0,1

1

10

0 50 100 150 200

0,001

0,01

0,1

1

10

0 100 200 3000,001

0,01

0,1

1

10

0 100 200 300

0,001

0,01

0,1

1

10

0 100 200 300

RT1

Fagos cóctel 2 (m.o.i. 10)

6. Pruebas de cócteles en medio LB

0,01

0,1

1

10

0 50 100 150 200

0,01

0,1

1

10

0 100 200 300

0,01

0,1

1

10

0 100 200 300

0,01

0,1

1

10

0 50 100 150 200

0,01

0,1

1

10

0 100 200 300

CÓCTEL 1m.o.i. < 1

CÓCTEL 2m.o.i. < 1

CÓCTEL 2m.o.i. ≥ 10

CÓCTEL1m.o.i. 100

MG1655

RT381

0,01

0,1

1

10

0 50 100 150 200

6. Pruebas de cócteles en medio LB

6. Pruebas de cócteles en lechem.o.i. ≈ 10CÓCTEL DE 3 FAGOS

7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto

Evolución de los recuentos de E. coli (RT1) a m.o.i. 10 y 30

7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto

Desarrollo de un sistema informático de análisis cuantitativo de los “ojos” o “burbujas”

7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto

Evolución de los “ojos” en quesos a m.o.i. 10 y 30

7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto

1D 4D

7D 28D

Control

Control

Control

Control

m.o.i. 10

m.o.i. 10

m.o.i. 10

m.o.i. 10

m.o.i. 30

m.o.i. 30

m.o.i. 30

m.o.i. 30

8. Pruebas del cóctel 5 en queserías

8. Pruebas del cóctel 5 en queserías

8. Pruebas del cóctel 5 en queserías

3

4

5

6

7

8

Control Ec Ec+Fago

Leche Queso 24h

Evolución del número de bacterias E. coli (RT144) por mL

9. Pruebas de cóctel en ganadería estabulada

Finca La Orden - Valdesequera

En progreso:• Ensayos en ganadería estabulada• Altas presiones: eliminación de fagos en el queso

Otras acciones del grupo:• Análisis de la infección de bacterias autóctonas por los fagos

autóctonos• Búsqueda y caracterización de fagos frente a Klebsiella oxytoca,

Enterobacter cloacae y Citrobacter braaki• Selección de fagos para un cóctel de amplio espectro• Nuevo sistema de detección de enterobacterias en alimentos• Evolución de poblaciones bacterianas durante la maduración• Valoración de la capacidad productora de gas de diferentes

especies bacterianas en los quesos extremeños

R. Tabla I. Roa

N. Balas

A. Gómez M.Pacheco

J.E. Rebollo

F. MolinaE. López

E. Ferrera