AVESA 2012, Santander 8 Noviembre

Ana Hurtado

Bacterias patógenas emergentes transmisibles por alimentos en

producción primaria

Campylobacter, Salmonella, Listeria, E. coli verotoxigénico

NEIKER - Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario Departamento de Sanidad Animal

Berreaga 1, 48160 Derio, Bizkaia

Tuberculosis

Reported notification zoonoses rates in

confirmed human cases in the EU, 2010

The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and food-borne

outbreaks in the European Union in 2010, The EFSA Journal (2012),

109(3):2597

Elaborado en cumplimiento del artículo 9 de la Directiva 2003/99/CE

- ↑ desde 2006 (6.7 % respecto 2009) -  Niños (<5 años): 127 casos/100.000hab -  casos esporádicos (8.9% todos brotes) -  C. jejuni (C. coli) -  0.22% mortalidad

-  ↓ desde 2005 (8.8% respecto 2009) - PNC -  30.5% todos brotes -  Enteritidis (ppal. causa brotes) – ↓ -  Typhimurium (resistencia antimicrobiana) – ↓ (↑) -  ↑ desde 2008 (12% respecto 2009)

-  O157 – 42.5% HUS -  Niños (4.7 casos/100.000h)

-  ↓ 3.2% -  gravedad (mayor mortalidad: 17%)

Principales agentes de zoonosis alimentarias – EU 2010

“Prevalencia y caracterización de patógenos bacterianos en la base de la cadena alimentaria - CAPV”

METODOLOGÍA

expected prevalence (p) of positive farms =5 - 10%; p positive animals =10% confidence (CI)=95%; precision (L)=2 - 10%

Table 1. Farm census and number and distribution of farms analysed

N º Farms Farms ( census ) analysed

Beef cattle ( > 10): 1538 124 Dairy cattle ( > 10): 890 82 Ovine ( > 100): 608 120 Porcine ( > 50): 23 17 Poultry ( > 1000): 34

expected prevalence (p) of positive farms =5 - 10%; p positive animals =10% confidence (CI)=95%; precision (L)=2 - 10%

Table 1. Farm census and number and distribution of farms analysed

N º Farms Farms ( census ) analysed

Beef cattle ( > 10): 1538 124 Dairy cattle ( > 10): 890 82 Ovine ( > 100): 608 Porcine ( > 50): 23 17

( 60

N º Farms Farms ( census ) analysed

Beef cattle ( > 10): 1538 124 Dairy cattle ( > 10): 890 82 Ovine ( > 100): 608 Porcine ( > 50): 23 17

( 377

EXPLOTACIONES POSITIVAS Explotaci ó n

positiva

POOL de heces de 30 animales Heces de 50 animales analizadas de manera

INDIVIDUAL

PREVALENCIA INDIVIDUAL: proporción animales excretores en el rebaño

PREVALENCIA de Explotaci ó n positiva

POOL de heces de 30 animales Heces de 50 animales analizadas de manera

INDIVIDUAL POOL de heces de 30 animales

Heces de 50 animales analizadas de manera INDIVIDUAL

Dos muestras de heces por nave tomadas de 30 puntos

(>5g / punto) para establecer la PREVALENCIA de

EXPLOTACIONES POSITIVAS a los 4 patógenos

Primer estudio a gran escala en explotaciones

del País Vasco para determinar la

prevalencia de los principales patógenos

alimentarios (2003-2006)

Campylobacter spp.

Clase Epsilonproteobacteria, Fam. Campylobacteraceae Bacilos Gram (-) curvados Microaerófilos (5-10 % O2) Medios enriquecidos Oxidasa positivos, móviles (flagelos polares) Especies termófilas (42 ºC) C. jejuni, C. coli, otras Tracto intestinal mamiferos y aves Carnes de ave, de cerdo, aguas

The EFSA Journal 2012, 109(3):2597

55,0 52,962,1

70,6

59,967,0

82,2

1,2

51,2

24,318,2

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

Ovino Porcino Vacuno Broilers

VC=58.9% VL=67.7%

8,8 57,8 5,4 66,7

Oporto et al. J. Appl. Microbiol. 103: 977-984 (2007) Esteban et al. Int. J. Food Microbiol. 123: 177-182 (2008)

Campylobacter spp.

Campylobacter spp.

CAPV 2003-06

Spain 2010

EU 2010

VACUNO

C. coli

C. jejuni

Campylobacter spp. (no identif.)

C. lari 0.1%

EU

28.9%

4.7% 60.9%

C. fetus 3.9%

C. lari 0.8% C. sputorum

0.8%

C. hyointestinalis

C. jejuni

C. coli

CAPV

45.8%

41.7%

Cj+Cc

12.5 %

C. coli

C. jejuni

C. lari – 0.2%

Campylobacter spp.

POLLOS

EU

CAPV

C. coli

C. jejuni

C. upsaliensis 0.1%

Campylobacter spp. (no identif.)

66.7%

33.3%

C. hyointestinalis

PORCINO

EU

CAPV

Campylobacter spp.

Campylobacter spp. – Report on Trends and Sources of Zoonoses UE 2010

The EFSA Journal 2012, 109(3):2597

17/27 brotes por

Campylobacter

carne ave

Campylobacter jejuni - Tipado

flaA PCR-RFLP

PFGE

Virulotyping

MLST

Resistencia antimicrobiana

CTGCTGTATTGCATTTTCTCTTTTTAT

CTGCTGTATTGCATTTTCTCTTTTTAT170171172173174175176177178179180181182183184185186187188189190191192193194195196

1600

0

Fragment66-­‐021244+RLBF

Campylobacter spp. – Conclusiones

Ä Además de las aves, rumiantes y cerdos son también importantes reservorios: • Porcino: C. coli

• Ovino y vacuno: C. jejuni Ä El tipado molecular de las cepas de C. jejuni mostró una asociación entre los tipos aislados de rumiantes y aquellos que se describen en casos esporádicos en el hombre Ä Aunque la carne de aves es considerada la principal fuente de infección de Campylobacter para el hombre, los resultados obtenidos demuestran que los rumiantes podrían suponer un riesgo

Salmonella spp.

Características: •  Bacilos Gram-, móviles •  Oxidasa- •  Anaerobio facultativo

Taxonomía: •  Clase Gammaproteobacteria •  Fam. Enterobacteriaceae •  2 especies: - Salmonella bongori - Salmonella enterica [6 subespecies (I-VI)]:

S. enterica subsp. arizonae S. enterica subsp. diarizonae S. enterica subsp. enterica S. enterica subsp. houtenae S. enterica subsp. indica S. enterica subsp. salamae

Salmonella spp.

•  59 antígenos SOMÁTICOS (O LPS) •  97 antígenos FLAGELARES (H) >2600 serotipos •  antigenos capsulares (Vi)

Serotipado: Determinación de la fórmula antigénica por aglutinación en placa con sueros anti-salmonella (Esquema Kauffmann-White)

Serotipos adaptados al hopedador: Bovino: S. Dublin Ovino: S. Abortusovis Aves: S. Gallinarum, S. Pullorum Porcino: S. Choleraesuis Hombre: S. Typhi, S. Paratyphi

No adaptados (zoonóticos) : •  S. Enteritidis 9,12: g,m: - •  S. Typhimurium 4,12:i:1,2 •  S. Infantis 6,7:r:1,5 •  S. Virchow 6,7:r:1,2 •  S. Hadar 6,8:z10:e,n,x

The EFSA Journal 2012, 109(3):2597

•  Huevos •  Carne de aves

•  Carne de cerdo

Salmonella spp. – Report on Trends and Sources of Zoonoses UE 2010

Reglamento (CE) 2160/2003: obligatoriedad medidas de detección y control de Salmonella y otros agentes zoonóticos transmitidos por alimentos:

Programas de Control ð CONTROL en ORIGEN (EXPLOTACIONES): reducción progresiva de su prevalencia en los reservorios animales

- Gallinas reproductoras - Gallinas ponedoras - Pollos de engorde - Pavos - Porcino de abasto y reproductoras

1.  Estudios de Prevalencia de Salmonella (Baseline studies) 2.  Fijación de objetivos para la reducción de Salmonella 3.  Planes Nacionales de Control (PNC) comienzo 18 meses tras fijado el

objetivo y duración 3 años

Salmonella spp. – Planes Nacionales de Control

Salmonella spp. en Explotaciones de Ponedoras – PNC

•  Animales silvestres (aves) •  Roedores e insectos •  Residuos

► Limpieza y desinfección de la granja después de cada fase productiva y previa a la introducción de nuevos animales

“todo-dentro-todo-fuera”

ANIMALES

AMBIENTE

Gallinas ponedoras

ALIMENTACIÓN

PERSONAS

GRANJAS

•  Localización y registro •  Instalaciones y materiales •  Transporte y accesos •  Manejo

Controles de Salmonella (muestreos y analíticas) •  Pollitas de reposición (1día) •  Fase de puesta: - 2 semanas antes

- cada 15 semanas Vacunación

•  Pienso (acabado y mat. primas) •  Agua

•  Personal: formación e información (Código de Buenas Prácticas de Higiene) •  Visitantes

SE/ST

Estudios de Prevalencia de Salmonella (Baseline studies 2005)

► En base a estos datos la UE estableció unos objetivos de reducción para los serotipos Enteritidis y Typhimurium en gallinas ponedoras

53,5

45,2

73,2

51,5

31,7

20,3

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

Salmonella spp. SE y/o ST

CAPVSpain

EU

(0-79,5) (0-62,5)

The EFSA Journal 2006, 81:1-71

Prevalencia de Salmonella spp., y S. Enteritidis / S. Typhimurium en manadas de gallinas ponedoras 2005

è Baseline Studies: Spain; EU è Programa Interdepartamental de Control y Minimización de Salmonella en la CAPV (2005): •  Dpto. Agricultura, Pesca y Alimentación (NEIKER) y Diputaciones Forales: Heces & polvo explotaciones ponedoras (43 explot., 113 manadas) •  Dpto. Sanidad: Huevos (cáscara e interior)

Salmonella en Ponedoras – UE 2008

The EFSA Journal, 2010 8(1):1496

Para prevalencia >40%: 40% reducción del número de manadas positivas

(51.5 è 30.9% en 2008)

15.6% 129/845

Salmonella en Ponedoras – UE 2009

The EFSA Journal, 2011 9(3):2009

Para prevalencia = 10-20%: 20% reducción del número de manadas positivas (15.6 è 12.8% en 2009)

7.2% 109/1511

Salmonella en Ponedoras – UE 2010

The EFSA Journal, 2012 10(3):2597

Para prevalencia <10%: 10% reducción del número de manadas positivas

(7.2 è 6.5% en 2010)

Final EU target: max. % SE/ST

POS = 2%

Final result: 1.9%

5.9% 89/1503

Salmonella spp. – Report on Trends and Sources of Zoonoses UE 2010

EU: 1.6% Sp: 5.4%

EU: 0.3% Sp: 5.3%

HUEVOS con SE

~ 65% casos salmonellosis en

EU (EFSA)

5,7 5,83,9

35,9

15,0

6,9 8,4

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

Ovino Porcino Vacuno

CAPV 2005Spain 2010 *EU 2010

* Sp – Estudio en mataderos CAPV & EU – a nivel de rebaño

CAPV: •  3 S. Typhimurium: ovino, vacuno de leche y vacuno de carne •  1 S. Enteritidis: vacuno de carne •  1 S. Virchow: vacuno de leche •  Otros serotipos: Diarizonae, Derby, Newport, Agona y Rissen

Clase Bacilli, Orden Bacillales, Fam. Listeriaceae Bacilo Gram +; no forma esporas Anaerobio facultativo Móvil (24 ºC) Temperatura – rango 4-42 ºC pH: 5.5-9.5 Listeriosis animal (forma nerviosa) Ubicua - Tracto intestinal animales - Aguas - Vegetación - Ensilados (pH>5.5) - Platos precocinados (RTE), Lácteos, patés, carnes, vegetales

“Prevalencia y caracterización de patógenos bacterianos en la base de la cadena alimentaria”

Listeria monocytogenes

“Prevalencia y caracterización de patógenos bacterianos en la base de la cadena alimentaria”

Listeria monocytogenes

Ø  EU 2010 (EFSA): Rumiantes Ø Organismo ubicuo difícil de eliminar de explotación (medidas de control para minimizar), aunque riesgo se asocia a precocinados ← contaminación durante procesado

Ø  Prevalencia CAPV Table 2. Prevalence values by animal sourceFarm Prevalence Within-herd Prevalence

Positive Farms Animal source Farms

anal N % (CI) n analysed

(herds) % pos

animals range

(per herds)

Sheep 120 17 14.2 (8.6-19.8)

197 (4) 1.5 0.0-4.1

Beef Cattle 124 38 30.6 (22.8-38.4)

39 (1) 7.7 n.a.

Dairy Cattle 82 38 46.3 (36.0-56.6)

182 (4) 24.1 5.1-72.3

Swine 17 0 0.0 n.d. - -

TOTAL 343 93 27.1 (22.7-31.5)

418 (9) 11.9 0.0-72.3

Table 2. Prevalence values by animal sourceFarm Prevalence Within-herd Prevalence

Positive Farms Animal source Farms

anal N % (CI) n analysed

(herds) % pos

animals range

(per herds)

Sheep 120 17 14.2 (8.6-19.8)

197 (4) 1.5 0.0-4.1

Beef Cattle 124 38 30.6 (22.8-38.4)

39 (1) 7.7 n.a.

Dairy Cattle 82 38 46.3 (36.0-56.6)

182 (4) 24.1 5.1-72.3

Swine 17 0 0.0 n.d. - -

TOTAL 343 93 27.1 (22.7-31.5)

418 (9) 11.9 0.0-72.3

Esteban et al. BMC Veterinary Research 2009, 5:2

- alta en rumiantes, s.t. vacuno de leche (excreción variable con el tiempo)

- ausencia en porcino

Listeria monocytogenes – Report on Trends and Sources of Zoonoses UE 2010

The EFSA Journal, 2012 10(3):2597

Listeria monocytogenes – Report on Trends and Sources of Zoonoses UE 2010

EU microbiological criteria for L. monocytogenes in RTE food: ≤100 cfu/g RTE (foods with <100 cfu/g pose a negligible risk) The EFSA Journal, 2012 10(3):2597

Listeria monocytogenes – Report on Trends and Sources of Zoonoses UE 2010

Aislamientos en: - Quesos blandos, semiblandos y duros -  Quesos de leche cruda y pasteurizada

The EFSA Journal, 2012 10(3):2597

Altos niveles (> 100 cfu/g) en blandos y semiblandos

Más + quesos blandos y semiblandos

- Clase Gammaproteobacteria, Fam. Enterobacteriaceae - Bacilos Gram (-), oxidasa- E. coli patógenos → Enfermedades entéricas/diarrea ð 6 patotipos

intestinales (adhesión, toxinas, invasión): •  Enterotoxigenic E. coli (ETEC) •  Enteroinvasive E. coli (EIEC) •  Enteropathogenic E. coli (EPEC) •  Diffusely adherent E. coli (DAEC) •  Enteroaggregative E. coli (EAggEC) •  Verotoxigenic E. coli (VTEC)

Escherichia coli

- Reservorio: rumiantes (cerdos, perros, gatos, caballos, aves) - Transmisión: carne de vacuno y de cerdo

Escherichia coli verotoxigénico (VTEC)

Ä verotoxigenic E. coli (VTEC) = Shiga-toxin E. coli (STEC): Verotoxinas (VT) o toxinas Shiga (Stx) responsables de la diarrea sanguinolenta y la enterocolitis hemorragica, y del daño renal

-  stx1 → Stx1 -  stx2 → Stx2

Ä Enterohemorrhagic E. coli EHEC (Subgrupo STEC) Stx + Isla patogenicidad LEE (eae) ð adherencia al intestino (A/E lesions)

Ø  Serotipos EHEC: O26, O103, O111, O157 ß Ppal causa HUS Ø  Importancia E. coli VTEC

ð Colitis Hemorrágica (HC) Síndrome urémico hemolítico (HUS)

• Fallo renal agudo • Anemia hemolítica microangiopática • Trombocitopenia

“Prevalencia y caracterización de patógenos bacterianos en la base de la cadena alimentaria”

E. coli verotoxigénicos (VTEC)

- Detección: • E. coli O157: Separación inmunomagnética → aislamiento • VTEC: MacConkey agar - PCR stx 10 colonias

- PCR genes de virulencia: O157:H7 • stx2+: 100%

• eaeA+: 95.9% • toxigenic profile stx2/eaeA/E-hlyA: 75.5%

no-O157 STEC • eaeA+ 5.3% 384 bp eaeA

255 bp stx2 180 bp stx1

Los aislados más patógenos constituyen un pequeño porcentaje de los que infectan a los rumiantes de la zona

Prevalencia Explotaciones Positivas Prevalencia

Individual VTEC O157:H7 O157:H7

OVINO 50.8 8.7 7.3 VACUNO 35.9 3.8 6.7 PORCINO / POLLOS 0.0 0.0 nd

50.8 8.7 7.3 35.9 3.8 6.7 0.0 0.0 nd

Oporto et al. Zoonoses and Public Health 55:73-81 (2008)

- Prevalencia

VTEC – Report on Trends and Sources of Zoonoses UE 2010

VTEC + O157 +VACUNO 0.0-53.8 0.0 - 17.6

OVINO 0.0-77.7 n.s.PORCINO 0.0-7.2 n.s.

•  Sp - Estudio en mataderos (national survey): 18.9 % VTEC Vacuno •  VTEC patógenos para el hombre en distintas especies animales (RUMIANTES)

Resultados no comparables entre MS (distintos métodos) Amplia variación entre MS

The EFSA Journal, 2012 10(3):2597

Conclusiones

•  La determinación de los niveles de prevalencia supone el primer paso antes de poder establecer medidas de control a nivel de las explotaciones

•  El caso de los PNC para Salmonella implementados en explotaciones de aves en la UE es un claro ejemplo de éxito en el control; Campylobacter?

•  En cualquier caso, diferencias en el sacrificio y posterior procesado de los distintos tipos de carne podrían también influir en el riesgo de contaminación asociado a los diferentes alimentos (Campylobacter, L. monocytogenes)

•  La posterior caracterización de los aislados de distintos orígenes supone una herramienta muy útil para establecer posibles fuentes de infección y vías de transmisión, y evaluar riesgos asociados al consumo de alimentos de distintos orígenes (atribución de fuentes)

Ø NEIKER •  Beatriz Oporto •  Gorka Aduriz •  Jon Esteban •  Ramón A. Juste

Ø Ganaderos y veterinarios clínicos

Ø  Diputaciones Forales Ø  Departamento de Sanidad del Gobierno Vasco Ø  ELIKA

Ø Fuentes Financiación:

Departamento de Medioambiente, Planificación Territorial, Agricultura y Pesca

Agradecimientos