Post on 16-Feb-2015
Actividad anti-cáncer de los extractos y sus Actividad anti-cáncer de los extractos y sus compuestos activos obtenidos de productos compuestos activos obtenidos de productos
naturalesnaturales
João Ernesto de CarvalhoJoão Ernesto de Carvalho
RIBECANCER
Itajaí – SC - BR26 – 28/11/2012
RIBECANCER
Búsqueda de nuevos medicamentos contra el cáncerBúsqueda de nuevos medicamentos contra el cáncer
Triage (screening) inicial en cultura de células tumorales humanasTriage (screening) inicial en cultura de células tumorales humanas
Estudios de los mecanismos de acciónEstudios de los mecanismos de acción
Modelos experimentales de cáncer en animales de laboratorioModelos experimentales de cáncer en animales de laboratorio
Estudios de toxicidadEstudios de toxicidad
Estudios clínicos Estudios clínicos
Triage (screening) inicial: Triage (screening) inicial: líneas celulares de cáncer humanolíneas celulares de cáncer humano
Leucemia (K 562) Pulmón (NCI H460) Mama (MCF 7) Ovario con fenotipo de resistencia a múltiplos fármacos (NCI ADR) Melanoma (UACC 62) Riñón (786 0) Colon (HT 29) Ovario(OVCAR 03) Próstata (PCO 3) Glioma (U251)
Triage Triage in vitroin vitroInoculaciónInoculaciónplacas de 96placas de 96
pocillospocillos
InoculaciónInoculaciónplacas de 96placas de 96
pocillospocillos
Adición de las Adición de las muestrasmuestras
Adición de las Adición de las muestrasmuestras
Fijación ácidaFijación ácidade la placa controlede la placa controle
(tiempo cero)(tiempo cero)
Fijación ácidaFijación ácidade la placa controlede la placa controle
(tiempo cero)(tiempo cero)
Fijación:Fijación:adición deadición de
ácidoácido
Fijación:Fijación:adición deadición de
ácidoácido
ColoraciónColoraciónSRBSRB
ColoraciónColoraciónSRBSRB
SolubilizaciónSolubilizacióndel colorantedel colorante(trizma base)(trizma base)
SolubilizaciónSolubilizacióndel colorantedel colorante(trizma base)(trizma base)
DensidadDensidadóptica óptica 540 nm540 nm
DensidadDensidadóptica óptica 540 nm540 nm
IncubaciónIncubación24 horas24 horas
IncubaciónIncubación24 horas24 horas
IncubaciónIncubación48 horas48 horas
IncubaciónIncubación48 horas48 horas
RPMI +RPMI +soro fetal bovinosoro fetal bovinoRPMI +RPMI +soro fetal bovinosoro fetal bovino
ContrContrcélulacélula
Branco Branco meiomeio
Branco substância testeBranco substância teste
11
D1D1 D2D2 D3D3
Branco substância testeBranco substância teste
22
44 5533
DoxorrubicinaDoxorrubicina
Holbeck, S.L. Update on NCI in vitro drug screen utilitiesEuropean Journal of Cancer 40 (2004) 785–793
UNIVALI/RIBECANCERUNIVALI/RIBECANCER
10-3 10-2 10-1 100 101 102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,5
Cre
scim
ento
Cel
ular
(%
)
U251 UACC-62 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT
120806 Ext MeOH G. achachairu galhos
0,25 10-3 10-2 10-1 100 101 102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,5
Cre
scim
ento
Cel
ular
(%
)
U251 UACC-62 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT
120806 Ext MeOH G. achachairu folhas
0,25
10-3 10-2 10-1 100 101 102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,5
Cre
scim
ento
Cel
ular
(%
)
U251 UACC-62 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT
120806 Ext MeOH G. achachairu sementes
0,25
10-3 10-2 10-1 100 101 102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,5C
resc
imen
to C
elul
ar (
%)
U251 UACC-62 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT
120806 DCLNFM
0,25
Colecta y IdentificaciónColecta y IdentificaciónColecta y IdentificaciónColecta y Identificación
Material vegetalMaterial vegetalMaterial vegetalMaterial vegetal
Extracto orgânicoExtracto orgânicoExtracto orgânicoExtracto orgânico Material vegetalMaterial vegetalMaterial vegetalMaterial vegetal
ExtractoExtractohidroalcoólicohidroalcoólico
ExtractoExtractohidroalcoólicohidroalcoólico
diclorometanodiclorometano
etanol 70%etanol 70%
Teste de actividadTeste de actividadanticâncer anticâncer in vitroin vitro
5-10 mg5-10 mg
Teste de actividadTeste de actividadanticâncer anticâncer in vitroin vitro
5-10 mg5-10 mg
segundasegundacolectacolecta
segundasegundacolectacolecta
FraccionamientoFraccionamientode los extractos activosde los extractos activos
FraccionamientoFraccionamientode los extractos activosde los extractos activos
FraccionamentoFraccionamentoDe los extractos activosDe los extractos activos
FraccionamentoFraccionamentoDe los extractos activosDe los extractos activos
Teste de actividadTeste de actividadanticâncer anticâncer in vitroin vitro
5-10 mg5-10 mg
Teste de actividadTeste de actividadanticâncer anticâncer in vitroin vitro
5-10 mg5-10 mg
AislamientoAislamientoprincípios activosprincípios activos
AislamientoAislamientoprincípios activosprincípios activos
Teste atividadeTeste atividadeantiproliferativaantiproliferativaTeste atividadeTeste atividadeantiproliferativaantiproliferativa
IdentificaciónIdentificaciónprincípios activosprincípios activos
IdentificaciónIdentificaciónprincípios activosprincípios activos
Estudios agronômicosEstudios agronômicosy cultivoy cultivo
Estudios agronômicosEstudios agronômicosy cultivoy cultivo
IdentificaciónIdentificaciónprincípios activosprincípios activos
IdentificaciónIdentificaciónprincípios activosprincípios activos
Extración y aislamientoExtración y aislamientoen gran cuantidaden gran cuantidad
Extración y aislamientoExtración y aislamientoen gran cuantidaden gran cuantidadsíntesissíntesissíntesissíntesis
MecanismoMecanismode acciónde acción
MecanismoMecanismode acciónde acción
Testes en Testes en animales de laboratorioanimales de laboratorio
0,1 – 100 gramos0,1 – 100 gramos
Testes en Testes en animales de laboratorioanimales de laboratorio
0,1 – 100 gramos0,1 – 100 gramos
FormulaciónFormulaciónfarmacéuticafarmacéuticaFormulaciónFormulaciónfarmacéuticafarmacéutica
ToxicologíaToxicologíapre-clínicapre-clínica
ToxicologíaToxicologíapre-clínicapre-clínica
Estudios clínicosEstudios clínicosFases I, II, III e IVFases I, II, III e IVEstudios clínicosEstudios clínicosFases I, II, III e IVFases I, II, III e IV
Testes in vivo
EBD - EBD - Pothomorphe umbellata Pothomorphe umbellata (Piperaceae) - pimienta(Piperaceae) - pimienta
Sacoman et al. Braz. J. Medical Biological Res. 41: 411, 2008 Sacoman et al. Braz. J. Medical Biological Res. 41: 411, 2008
Tumor ascitico de Ehrlich en ratones
Inoculación 0,5 mL 104 celulas del tumor de Ehrlich en el abdomen de ratones
Inoculación 0,5 mL 104 celulas del tumor de Ehrlich en el abdomen de ratones
ip. viaip. viaTratamientos: 40, 110 y 180diaControle negativo: salinaControle positivo: doxorrubicina 5 mg/ kg EBD 100, 200 y 400 mg/ kg
Tratamientos: 40, 110 y 180diaControle negativo: salinaControle positivo: doxorrubicina 5 mg/ kg EBD 100, 200 y 400 mg/ kg
Pós-inoculación
Numero y fechas de las muertes ANOVA y curva
de sobrevida Kaplan-Meier
Numero y fechas de las muertes ANOVA y curva
de sobrevida Kaplan-Meier
n=10n=10
Sacoman et al. Braz. J. Medical Biological Res. 41: 411, 2008Sacoman et al. Braz. J. Medical Biological Res. 41: 411, 2008
Tumor ascítico de Ehrlich: curva de sobrevida
Tumor sólido Ehrlich en ratonesTumor sólido Ehrlich en ratones
Las celulas del tumor de Ehrlich son inoculadas en la pata Las celulas del tumor de Ehrlich son inoculadas en la pata
Evaluación:Evaluación:
– medida del volumen de la patamedida del volumen de la pata
– peso relativo del tumorpeso relativo del tumor
– analises histológicasanalises histológicas
– aumento de peso de los animales aumento de peso de los animales
Pletismometro: determinación del volumen tumoral Pletismometro: determinación del volumen tumoral
Tumor sólido de Ehrlich en ratonesTumor sólido de Ehrlich en ratones
Dosis de 30 mg/kg inibición de crecimiento
Metástasis pulmonar inducida pela linaje B16-F10 (melanoma)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
conc
entr
ação
de
mel
anin
a/m
assa
pul
mão
veículo rac-GTN 100mg/kg
*
Fibra semipermeable (Hollow-fiber)Fibra semipermeable (Hollow-fiber)
- - Encapsulamiento de la linaje tumoral y Encapsulamiento de la linaje tumoral y incubación por incubación por 24 horas24 horas
- Implante de las fibras en ratonesImplante de las fibras en ratones Balb-C, tBalb-C, tejido subcutáneo dorsal y ejido subcutáneo dorsal y
abdomenabdomen
TratamientosTratamientos
- - Sacrificio en el 14º. día para evaluación Sacrificio en el 14º. día para evaluación de la viabilidad celular por de la viabilidad celular por MTTMTT
Fibra semipermeable: tejido subcutáneo dorsal y abdomenFibra semipermeable: tejido subcutáneo dorsal y abdomen
Hollow-Fiber – Hollow-Fiber – K. coriaceaK. coriacea (Fr7) (Fr7)
Salina Doxorrubicina Fr7
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
**
**
****
Ab
sorb
an
ce MCF7 NCIADR OVCAR
Hollow-fiber: Hollow-fiber: abdomen abdomen Hollow-fiber: Hollow-fiber: abdomen abdomen
Hollow-FiberHollow-Fiber model – model – K. coriaceaK. coriacea ( (Fr7)Fr7)
Salina Doxorrubicina Fr70,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
****
Ab
so
rba
nce
MCF7 NCIADR OVCAR
Hollow-fiber: Hollow-fiber: subcutáneo dorsal subcutáneo dorsal Hollow-fiber: Hollow-fiber: subcutáneo dorsal subcutáneo dorsal
Metodologías en desarrolloMetodologías en desarrollo
Tumor xenográficoTumor xenográficoCitometria de flujoCitometria de flujo
GraciasGraciasJoão Ernesto de Carvalho
Divisão de Farmacologia e ToxicologiaCPQBA – Unicamp
carvalho@cpqba.unicamp.br