Post on 09-Jul-2016
Dr. Miguel Lecuona Rodríguez
Departamento de Biología Celular y Tisular
Facultad de Medicina, UNAM
Universidad Autónoma del Estado de México.
2015
Técnicas de Procesamiento
Curso de Histología
¿Qué es la Técnica Histológica?
Son una serie de pasos físicos y químicos
para obtener una muestra susceptible de
ser analizada al microscopio
Células NO procesadas
Se observan en microscopio de contraste de
fases o de campo oscuro:
– Células de la sangre
– Células de descamación
Células Procesadas
• Técnica histológica ordinaria
• Técnica de corte por congelación
• Técnicas de tinción selectiva
• Técnicas de histoquímica enzimática
• Técnicas de inmunomarcaje
Otras Técnicas (Investigación)
• Técnicas para microscopia electrónica
• Técnica de impregnación metálica o
argéntica
• Ultracentrifugación diferencial
• Cultivo de células o tejidos
Técnica Histológica Ordinaria
1. Obtención de la muestra
2. Fijación
3. Deshidratación
4. Aclaración o diafanización
5. Infiltración
6. Inclusión
7. Corte
8. Desparafinización
9. Rehidratación
10. Tinción
11. Deshidratación
12. Aclaración
13. Montaje
Obtención de la muestra Ser vivo: biopsia
• Circunstancias o condiciones: – De rutina
– Transoperatoria
• Cantidad de tejido que se toma de la lesión:
– Insicional: un fragmento de la lesión
– Excisional: toda la lesión, pudiendo tener fin terapéutico
• Procedimientos:
– Corte
– Raspado: de sistemas epiteliales ó citologia exfoliativa (cervico-vaginal – citobrush o abatelenguas)
– Legrado
– Punción • Aspiración con aguja fina (BAAF)
• Aspiración con aguja gruesa (Tru-cut)
– Endoscopia
Cadáver: necropsia
FIJACIÓN
• Conservación de la estructura, evitar cambios postmortem, como la autolisis, la putrefacción o la proliferación
• Química: desnaturaliza proteínas proteolíticas, estabiliza membranas, inactiva enzimas (autolisis), antisépticos (evita proliferación de microorganismos)
• Física: congelación
FIJACIÓN
Los fijadores mas usados son:
• Formol (formaldehído) al 10%: endurece el tejido y tiene capacidad de penetración al espacio intracelular, buen poder fijador; se usa de 12 a 24 horas (ideal); se utiliza un volumen de 1 a 20 veces el tamaño de la muestra.
• Glutaraldehido, tetraóxido de osmio (para ME)
• Alcohol Etílico al 50% o 70%
• Mezclas fijadoras; spray: formol-fosfato
• Otros: Bouin, Zenker, Sanboni
Deshidratación
• Es gradual para evitar la refracción
• Se utiliza etanol o alcohol etílico al 30%,
50%, 70% y 100%
Aclaramiento o diafanización
• Se utiliza como ayudante para observar con mayor calidad los compartimientos celulares
• Se utilizan solventes como: Xilol, Toluol o
Cloroformo (Agentes Aclarantes)
• Se dan 2 baños al menos
INCLUSIÓN
• Solubles en agua: gelatina, carbowax,
metacrilato de glicol
• Solventes orgánicos: parafina, celoidina
CORTE
• Se utiliza el micrótomo
• Van de 4 a 8 micras por lo general
• Se va generando un “listón” de cortes
• Se colocan en una bandeja en “baño María” con gelatina o albúmina
• Se separan y se colocan en portaobjetos
TINCIÓN
Se utiliza para dar contaste a la muestra
• Monocrómica (1 colorante) Azul de toluidina
• Bicrómica (2 colorantes) H-E núcleo azul-morado, el resto rosa-naranja
• Tricrómica (3 colorantes) Masson: núcleo-azul oscuro, citoplasma-rojo, colágena-azul, músculo- rojo;
TINCIÓN
• Hematoxilina: azul-morado, base
(basofilia). Núcleos (ácido y basofilo)
• Eosina: rosa-naranja, ácido (acidofilia)
citoplasma (básico y acidofilo)
TINCIÓN
• Ortocromasia: se respeta el color del colorante
• Metacromasia: cambio del color original del colorante (tonalidades) Vg. Azul de Toluidina
• Pancromasia: mezcla de varias colorantes neutros, da como resultado varios colores y tonalidades Vg. Wright y Giemsa
MONTAJE
• Se coloca un cubreobjetos a la muestra
junto con Resina Sintética o Bálsamo de
Canadá, como pegamento formando una
capa transparente y adhesiva.
TÉCNICA DE CORTE POR
CONGELACIÓN • Usos: en procesamiento de biopsias
transoperatorias
• Obtención: biopsia transoperatoria
• Fijación: por congelación
• Corte: criostato (micrótomo en gabinete refrigerado a una temp. de -20º C en el interior)
• Tinción: HE
• Tiempo estimado: 10 minutos
• La preparación solo se puede observar al momento
• Otros usos: pruebas de histoquímica enzimática, evitando el uso de AA polares como xilol.
TÉCNICAS DE TINCIÓN SELECTIVA
Se tiñen determinados componentes celulares con colorantes específicos:
• Para lípidos: – Sudan III y IV: rojos o naranjas
– Sudan negro: negro
– Rojo oleoso: rojo
– Ácido osmico (tetraoxido de osmio): negro
• Para glucógeno y glucoproteínas: – Ácido peryódico de Schiff (PAS); Rojo-magenta para glucógeno, Rojo para glucoproteínas
– Carmín de Best: glucogeno
• Para DNA sin RNA – Técnica de Feulgen: rojo ( el RNA no reacciona)
• Bensley y Cains: para mitocondrias
• Dafano (sales de plata): para aparato de Golgi
• Wilder (argentica): para fibras reticulares: café a negro
• Reyes (rojo), Orceina (amarillo), Verhoeff (café): para fibras elásticas
HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA
• Detecta un grupo de enzimas específicas
(la misma enzima)
• Se va a observar en forma de precipitado
denominado MARCA
• Enzima + sustrato = producto(s) +
revelador = MARCA
INMUNOMARCAJE
Se utilizan anticuerpos, se identifican moléculas altamente específicas
Inmunoflorescencia
• se utiliza un compuesto fluorescente
• muestra fluorescentes los anticuerpos a los cuales se les pega el antigeno
• Puede ser directa: 1 antígeno por 1 anticuerpo
• Puede ser indirecta: 1 antígeno por varios anticuerpos
Inmunohistoquímica
• se utiliza para marcar enzimas
Pénfigo vulgar
CASO CLÍNICO
Mujer de 58 años
– Lesión difusa en mama derecha que infiltra piel y
complejo aréola – pezón
TÉCNICA PARA MET Mismos pasos que la técnica ordinaria:
Diferencias:
• Fijación; en vez de formaldehído se utiliza glutaraldehido
• Infiltración; en vez de parafina se utilizan resinas plásticas (epóxicas) Vg. EPON y Araldita
• Corte: va de 60 a 100 nanometros, se utiliza un ultramicrótomo cuyas cuchillas son de vidrio o diamante
• Se utilizan rejillas de cobre en lugar de portaobjetos
• No se quita la resina
• Para el contrastado se utilizan sales de metales pesados como el acetato de plomo y el acetato de Uranilo
IMPREGNACIONES METÁLICAS O
ARGÉNTICAS
• En lugar de usar tinción de color, se
utilizan sales de Oro y Plata (tonos de
café a negro)
• Se utilizan para procesar muestras de:
– tejido nervioso (se tiñen bien las diferentes
células gliales)
• La metenamina de plata permite marcar o
teñir laminas basales al igual que PAS
ULTRACENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
• Se utiliza para separar organelos
• Después de la centrifugación se obtiene un sedimento y un sobrenadante
Ejemplo:
• 1. A la primera centrifugación quedan: en sedimento células completas y en el sobrenadante mitocondrias y otros organelos
• 2. Al repetir el proceso en el sedimento quedan los núcleos y en el sobrenadante los demás organelos
• 3. Al repetir el proceso en el sedimento quedan mitocondrias y en el sobrenadante ribosomas
CULTIVO DE CÉLULAS Y/O TEJIDOS
El procedimiento general es el siguiente:
• Obtención de células
• Separación de células (si es que no están separadas)
• Se colocan en cajas con medio de cultivo (líquidos a semi-líquidos, tienen nutrientes y son distintos a los de las bacterias)
• Se introducen en incubadores de cultivo, manteniendo temperaturas de 37ºC aprox.
• Se da un intercambio gaseoso 02-CO2
– En buenos cultivos las células se pueden reproducir (se resiembran)
– Esta técnica se usa en investigación mas que en clínica
– En cultivo de tejidos las células deben organizarse para formar el tejido (Ingeniería de cultivo de tejidos); las cepas de HELA, es la que se ha adaptado mejor a las condiciones de cultivo, estas vienen del tumor de una mujer desde finales de 1950.