1

2

Clonación de fragmentos de DNA

3

MiniprepsPreparación de plásmido por lisis alcalina

Disolución P1•Tris 50 mM pH 8.0•EDTA 10 mM

+ RNasa 0.1 mg/ml

Disolución P2•NaOH 0.2 N•SDS 1%

Disolución P3•Acetato potásico 3M•Áciso acético 11%

Birnboin H.C., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic acids research 7(6):1513-1522

Birnboin H.C., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for the isolation of plasmid DNA. Methods in Enzymology 100:243-256

4

Endonucleasas de restricción

5

6

7

Reacción catalizada por la DNA Ligasa

Lehninger. Principios de Bioquímica

8

La defosforilación con fosfatasa alcalina evita el religado del vector

9

La Fosforilación con polinucleótido quinasa facilita la ligación de fragmentos de DNA

10

Síntesis en fase sólida de una cadena de DNA por el método del triéster fosfito

(Dimetoxitritilo)

(-cianoetil)

Finalmente se añade NH3 para eliminar los grupos protectores y liberar el oligonucleótido del soporte sólido

SÍNTESIS QUÍMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

11

PUNTOS CLAVE DE UNA DNA POLIMERASA

• Fidelidad. La mantiene en dos etapas:

– Sólo forma enlace fosfodiéster si el nucleótido entrante está correctamente empareado con el molde (error 10-4).

– Si el emparejamiento ha sido incorrecto y aun así se ha formado enlace, lo hidroliza con su actividad 3’ exonucleasa (error final 10-6)

• Eficiencia catalítica.

– Depende fundamentalmente de la procesividad (1minuto asociación-reasociación enzima-DNA; 1milisegundo adición de cada nucleótido)

12

COMPARACIÓN DE LAS DNA POLIMERASAS I, II Y III DE E. Coli

Lehninger. Principios de Bioquímica

13

Secuenciación de DNAMétodo de Sanger automatizado

Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´Oligo: 5´--C T T A A

- DNA polimerasa- Nucleótidos dATP, dCTP, dGTP, dTTP-Terminadores fluorescentes ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP

5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´

5´--C T T A A G C G A T T A C -3´

5´--C T T A A G C G A T T A -3´

5´--C T T A A G C G A T T -3´

5´--C T T A A G C G A T -3´

5´--C T T A A G C G A -3´

5´--C T T A A G C G -3´

5´--C T T A A G C -3´

5´--C T T A A G -3´

Detector de fluorescencialáser

Separación de los

fragmentos de DNA

marcados, mediante

electroforesis capilar

-

+

G C G A T T A C G . . .

14

       1 tggtcttcagATGTCTGATTCGCTAAATCA     150 accagaagtcTACAGACTAAGCGATTTAGT

      31 TCCATCGAGTTCTACGGTGCATGCAGATGA     120 AGGTAGCTCAAGATGCCACGTACGTCTACT

      61 TGGATTCGAGCCACCAACATCTCCGGAAGA      90 ACCTAAGCTCGGTGGTTGTAGAGGCCTTCT

      91 CAACAACAAAAAACCGTCTTTAGAACAAAT      60 GTTGTTGTTTTTTGGCAGAAATCTTGTTTA

     121 TAAACAGGAAAGAGAAGCGTTGTTTACGGg      30 ATTTGTCCTTTCTCTTCGCAACAAATGCCc

15

Marcaje de sondas de DNA“Random primer”

5´-CAATGGCGCCCGGTATTCGTAGTTTCTGGCACCGCATTTCGGA-3´:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::

3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGCCT-5´

5´-CAATGGCGCCCGGTATTCGTAGTTTCTGGCACCGCATTTCGGA-3´

3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGCCT-5´

DNA polimerasadATP, dGTP, dTTP, 32P-dCTPOligonucleótidos aleatorios

TAAAGC-5´

5´-GCGCCC 5´-TGGCACCGCATTTCGGA-3´GGTATTCGTAGT

3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCG

16

Sistemas de expresión bacterianos

17

Sistemas de expresión bacterianos basados en la RNA polimerasa de T7

18

19

Sistemas de expresión bacterianos: precipitación de proteínas recombinantes

20

Sistemas de expresión bacterianos: “refolding” de proteínas recombinantes

21

Utilización de transcriptasa reversa para obtener cDNA

IVIII V VI VIIIVII II I exonesDNA

Pre- mRNA

mRNA maduro AAAA

Transcripción

Maduración

TTTTAAAA

Transcripción reversa

cDNA

22

MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES

• Eliminación en la mayoría de los casos de la formilmetionina en procariotas y de la metionina iniciadora en eucariotas en el extremo N-t.

• Fosforilación de ciertos residuos de Ser, Thr y Tyr en algunas proteínas.

23

MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES

• Unión de grupos lipídicos (isoprenilación, palmitoilación, miristoilación)

24

MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES

• Glicosilación (adición de glúcidos) de residuos de Asn mediante enlaces N-glicosídicos o de residuos de Ser o Thr mediante enlaces O-glicosídicos.

• Formación de puentes disulfuro.

• Modificación proteolítica. Algunas proteínas, como la insulina, la tripsina, la quimotripsina, se sintetizan como precursores inactivos, y han de ser procesadas proteolíticamente para dar sus formas activas, más pequeñas.

25

Envío de proteínas al Retículo Endoplásmico

26

Sistemas de expresión en células animales

27

Introducción de DNA en células animales

• Carácter transitorio. El DNA sólo es introducido en parte de las células del cultivo. No se aplica selección. El cultivo se recoge y analiza al cabo de unos pocos días.

• Carácter estable. El vector debe contener un marcador (p.ej. un gen de resistencia a un antibiótico) que permita seleccionar las células en las que se ha introducido el DNA e integrado en el genoma. Se pueden aislar clones individuales o trabajar con toda la población.

28

Introducción de DNA en células animales

• Transfección.• Polímeros catiónicos (DEAE-Dextrano, Polietilenimina (PEI)

• Fosfato cálcico

• Lípidos catiónicos

• Transducción.

• Partículas virales. Retrovirus

• Microinyección

• Electroporación.

29

Introducción de DNA en células animales• Transfección.• Polímeros catiónicos (DEAE-Dextrano, Polietilenimina (PEI), FuGENE

• Fosfato cálcico• Lípidos catiónicos (Lipofectamina)

30

Introducción de DNA en células animales

• Electroporación.

31

Introducción de DNA en células animales• Transfección transitoria: éxito parcial

32

Introducción de DNA en células animales

• Transducción

Célula empaquetadora

Célula diana

33

Introducción de DNA en células animales

• Transducción

34

Sistemas de expresión inducibles

Transgénicos induciblesTransgénicos inducibles

collagen II tTA

Collagenase 3TRE

doxicyclin

35

collagen II tTA

Collagenase-3TRE

doxicyclin

Transgénicos induciblesTransgénicos inducibles

36